Генетическая инженерия

Способы получения генетического материала

Первый шаг в создании рекомбинантных молекул — выделение или искусственный синтез целевого гена. Для этого в генетической инженерии применяется несколько основных подходов:

• Выделение природных генов. Генетические структуры (хромосомы или плазмиды) изолируются целиком. Для точного извлечения нужного участка используется ферментативное выщепление с помощью рестриктаз — ферментов рестрикции, которые разрезают ДНК по строго определенным связям. Если же объектом выступает РНК, применяются рибозимы (ферменты, действующие аналогично рестриктазам).
• Химический синтез. Подходит для создания относительно небольших генов. Процесс включает три этапа: анализ белка с определением последовательности аминокислот $\rightarrow$ перевод аминокислотной последовательности в нуклеотидную (на основе кодонов) $\rightarrow$ непосредственный синтез гена на специальном аппарате (синтезаторе).
• Обратная транскрипция. Используется при работе с РНК-вирусами. С помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы) генетическая информация переписывается с вирусной РНК на ДНК.

Конструирование вектора и системы экспрессии

После получения целевого гена его необходимо встроить в систему доставки — вектор. Сшивание нужного гена с векторной ДНК осуществляется ферментами лигазами (процесс лигирования). В качестве векторов обычно используют плазмиды, бактериофаги, а также вирусы человека, животных или растений.

Далее рекомбинантная молекула ДНК вводится в клетку-реципиента (клетку-хозяина). Суть процесса в том, что после встраивания гибридного гена клетка приобретает новое свойство и начинает синтезировать несвойственное ей вещество.

Организмы-реципиенты:

1. Бактерии (например, E. coli, B. subtilis, псевдомонады).
2. Дрожжи.
3. Вирусы.

При выборе реципиента учитывают его способность встроить чужеродный ген, уровень экспрессии (насколько выражен будет синтез), экологическую безопасность, легкость массового культивирования и способность к секреции продукта наружу (в культуральную среду).

Проблемы производства и химерные белки

На этапе наработки нужного вещества биотехнологическое производство сталкивается с рядом задач. Ученые создают штаммы-суперпродуценты, способные перестроить метаболизм так, что до половины производимого ими белка является целевым чужеродным продуктом.

Однако высокая экспрессия не решает всех проблем. Если клетка не секретирует продукт в среду, для его извлечения требуется разрушение (дезинтеграция) самой клетки. Кроме того, существует риск сохранности продукта: целевой белок может быть разрушен внутриклеточными протеазами или ингибиторами еще в процессе синтеза.

Для облегчения узнавания и выделения вещества используется методический прием создания химерных белков. К гену нужного белка заранее присоединяют ген-индикатор (например, ген $\beta$-галактозидазы или ген интерферона). В результате клетка синтезирует единый гибридный белок, который легко обнаружить. После выделения маркерную часть отсекают, получая чистый целевой продукт.

Практическое применение и барьеры внедрения

Генетическая и белковая инженерия позволяет решать широчайший спектр медицинских задач, включая терапию врожденных генетических патологий и направленное влияние на геном. Уже сегодня методом генной инженерии созданы сотни препаратов:

• Вакцины: против гепатита В.
• Гормоны: инсулин, гормоны роста, эритропоэтин.
• Иммунные препараты: интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухолей (TNF), миелопептиды, пептиды тимуса, моноклональные антитела.
• Препараты для системы гемостаза: тканевой активатор плазминогена, факторы свертывания крови.
• Диагностикумы: антигены ВИЧ.

В ближайшем будущем ожидается появление рекомбинантных вакцин против малярии, сифилиса, клещевого энцефалита, бешенства, а также новых колониестимулирующих факторов и нейропептидов.

Препятствия на пути внедрения (все они преодолимы):

• Вопросы безопасности: опасения из-за риска распространения рекомбинантных микробов (в настоящее время биологическая безопасность доказана при соблюдении правил работы).
• Технологическая сложность (процессинг): необходимость разработки сложных многоэтапных схем очистки целевого белка от культуры продуцента.
• Проблема идентичности (биоэквивалентность): необходимость строгих доказательств того, что искусственный белок полностью идентичен природному аналогу, вплоть до правильной укладки молекулы.

Вопросы с занятий и экзамена

Что ещё разобрать по теме

• Механизм действия ферментов рестрикции и ДНК-лигаз
• Схемы дезинтеграции бактериальных клеток для выделения продуктов
• Отличия плазмидных и вирусных систем доставки (векторов)
• Перспективные разработки рекомбинантных вакцин (ВИЧ, малярия, сифилис)

Другие темы раздела «Биотехнология. Генетическая инженерия»

Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.