Физико-химическая основа метода
Фундаментом метода молекулярной гибридизации выступает уникальное физико-химическое свойство молекулы ДНК. Она способна к обратимым структурным изменениям в ответ на температурные колебания окружающей среды.
Ключевые процессы, происходящие с ДНК:
- Денатурация. Это процесс расплетения цепей. Он запускается при нагревании среды до $90^\circ\text{C}$, при этом реакция обязательно должна протекать в щелочных условиях. В результате двухцепочечная структура распадается на отдельные нити.
- Ренатурация. Это процесс восстановления исходной двухцепочечной спирали. Для того чтобы нити снова соединились, температуру необходимо снизить на $10^\circ\text{C}$ от уровня денатурации.
Именно эта способность к расплетению и последующему соединению комплементарных участков позволяет исследователям искусственно «спаривать» нити из разных источников, чтобы оценить их сходство.
ДНК-зонд как эталон сравнения
Для того чтобы найти специфическую последовательность в исследуемом образце, используется специальный инструмент — зонд.
Зонд представляет собой одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты. Чтобы гибридизацию можно было зафиксировать приборно, эту эталонную молекулу предварительно метят специальными маркерами — в классическом варианте для этого используются радиоактивные нуклиды.
В ходе анализа зонд выполняет функцию строгого эталона: он вступает во взаимодействие только с теми участками исследуемой ДНК, которые обладают высокой степенью гомологии (комплементарности) по отношению к нему.
Алгоритм проведения классической реакции
Процедура классической молекулярной гибридизации состоит из нескольких последовательных шагов, каждый из которых критически важен для получения достоверного результата:
- Подготовка образца. Исследуемую ДНК микроорганизма подвергают термической денатурации, чтобы расплести двухцепочечную молекулу на отдельные нити.
- Фиксация. Одну из полученных нитей исследуемой ДНК прочно закрепляют на поверхности специального фильтра.
- Гибридизация. Подготовленный фильтр с зафиксированной нитью погружают в раствор, содержащий радиоактивно меченый зонд.
- Оценка результата. Положительным результатом считается образование гибридной двухцепочечной спирали. Это происходит только в том случае, если между ДНК микроба и эталонным зондом имеется комплементарность.
Технология микрочипов
Современной и высокопроизводительной модификацией молекулярной гибридизации является технология микрочипов. Принцип устройства такого чипа базируется на использовании стеклянной пластины (матрицы). На этой пластине в строго определенных локусах зафиксированы ДНК-зонды. Один микрочип может содержать от 100 до 1000 видов зондов, каждый из которых специфичен для конкретной таксономической единицы микробов.
Этапы анализа на микрочипе:
- Выделение. Из предоставленного клинического или лабораторного образца извлекают общую массу ДНК.
- Амплификация. Проводят размножение стабильной генетической последовательности. Как правило, мишенью выступает ген 16S РНК.
- Мечение. Полученную на предыдущем этапе ДНК метят. В отличие от классического метода, здесь чаще используют флуорохром или специфический фермент.
- Гибридизация. Непосредственная обработка поверхности микрочипа подготовленной меченой ДНК.
- Отмывка. Тщательное удаление всей ДНК, которая не связалась с зондами на матрице.
- Детекция. Определение локализации образовавшихся гибридов. Они выглядят как светящиеся точки. Считывание проводится с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) или метода денситометрии. Локализация свечения позволяет точно идентифицировать вид микроба.
Чтобы запомнить температурный режим работы с ДНК, используйте правило «90 минус 10»: при 90°C в щелочной среде ДНК расплетается (денатурация), а при снижении на 10°C — собирается обратно (ренатурация).
Вопросы с занятий и экзамена
Что такое ДНК-зонд и зачем он нужен?
Это одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченая радиоактивными нуклидами. Она используется как эталон для поиска гомологичных участков в исследуемой ДНК.
Как оценивается положительный результат гибридизации?
Положительный результат фиксируется, когда между зондом и исследуемой нитью ДНК образуется гибридная двухцепочечная спираль благодаря их комплементарности.
Какой ген чаще всего амплифицируют при анализе на микрочипе?
Обычно для размножения и последующего анализа выбирают стабильную последовательность — ген 16S РНК.
Чем метят ДНК при использовании технологии микрочипов?
В технологии микрочипов амлифицированную ДНК метят флуорохромом или ферментом, что позволяет детектировать гибриды в виде светящихся точек.
Что ещё разобрать по теме
- Механизмы денатурации и ренатурации нуклеиновых кислот
- Принципы радиоизотопного мечения ДНК-зондов
- Роль гена 16S РНК в таксономии и идентификации бактерий
- Использование денситометрии и ИФА для детекции результатов на микрочипах
Разберите тему целиком в курсе «Микробиология»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Метод молекулярной гибридизации» и ещё 4 383 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 141 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Генетика микробов»
Бесплатные видеоуроки: микробиологияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.