Метод риботипирования

Генетическая база метода

Для того чтобы понять, как работает риботипирование, необходимо разобраться в организации генетического материала бактерий. Гены, отвечающие за кодирование рРНК, собраны в специфические структуры — опероны.

Важнейшим свойством нуклеотидной последовательности внутри таких оперонов является ее высокая консервативность. Это означает, что у всех представителей одного конкретного вида бактерий эти участки максимально схожи. При этом в самой бактериальной хромосоме данные опероны существуют не в единственном экземпляре, а всегда представлены несколькими копиями.

Принцип вариабельности

Если гены рРНК так похожи, как же мы отличаем один вид от другого? Дифференцировка микроорганизмов в методе риботипирования строится на трех ключевых отличиях, которые уникальны для разных видов бактерий:

1. Количество копий рРНК-оперонов в хромосоме.
2. Топография (локализация) этих копий непосредственно в геноме.
3. Расположение сайтов рестрикции — специфических мест, где ферменты разрезают ДНК. Эти сайты могут располагаться как внутри самого оперона, так и на его флангах (соседних прилегающих участках).

Техника выполнения риботипирования

На сегодняшний день весь процесс риботипирования полностью автоматизирован, что исключает человеческий фактор и ускоряет получение результата. Классическая схема исследования включает три основных шага:

• Рестрикция. Предварительно выделенную бактериальную ДНК обрабатывают специальными ферментами — рестриктазами. Их задача — разрезать длинную молекулу ДНК на короткие фрагменты в строго определенных местах (сайтах рестрикции).
• Гибридизация. Полученные фрагменты ДНК подвергают молекулярной гибридизации с заранее подготовленной и меченой рРНК того вида, который мы предполагаем обнаружить.
• Профилирование. В результате связывания формируется уникальный паттерн (профиль) фрагментов, который характерен исключительно для конкретного вида или даже отдельного штамма бактерий.

Опосредованная транскрипцией амплификация рРНК

Этот родственный метод используется преимущественно тогда, когда необходимо диагностировать смешанные инфекции (микст-инфекции). Его суть заключается в выявлении специфических рРНК бактерий путем их искусственного накопления с последующей гибридизацией.

Процесс протекает в автоматических анализаторах и позволяет одномоментно выявлять рРНК сразу нескольких видов бактерий. Исследование проходит в три стадии:

1. Амплификация. На матрице предварительно выделенной ДНК синтезируется огромный пул (множество копий) рРНК. Ключевым ферментом на этом этапе выступает ДНК-зависимая РНК-полимераза.
2. Гибридизация. Накопленную в большом количестве рРНК связывают с комплементарными видоспецифическими олигонуклеотидами (зондами). Чтобы результат можно было увидеть, эти зонды обязательно метят флюорохромами или ферментами.
3. Детекция. Результаты гибридизации считываются инструментально. Для этого применяют такие методы, как денситометрия или иммуноферментный анализ (ИФА).

При диагностике микст-инфекций амплифицированный пул рРНК просто разделяют на несколько отдельных проб. В каждую такую пробу добавляется свой собственный меченый олигонуклеотид, который строго специфичен для одного конкретного возбудителя.

Вопросы с занятий и экзамена

Что ещё разобрать по теме

• Строение и функции рРНК-оперонов у прокариот
• Механизм действия бактериальных рестриктаз
• Принципы молекулярной гибридизации
• Инструментальная детекция: денситометрия и ИФА
• Применение флюорохромов в молекулярной биологии

Другие темы раздела «Генетика микробов»

Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.