Факторы растворимости и электрический заряд
Способность белков растворяться в воде зависит как от их собственных характеристик (соотношение полярных и неполярных радикалов, устойчивость к денатурации), так и от параметров среды: температуры, солевого состава, наличия органических веществ и показателя кислотности (pH).
Ключевую роль играет суммарный заряд молекулы. Он формируется за счет ионизированных групп аминокислот — отрицательных карбоксильных и положительных аминогрупп. Изменение pH среды сдвигает этот баланс:
- В кислой среде (при избытке протонов водорода) подавляется диссоциация карбоксильных групп. Белок теряет отрицательные заряды и становится более положительным.
- В щелочной среде (при избытке гидроксил-ионов) протоны отрываются от аминогрупп, превращая их в нейтральные. В результате белок теряет положительный заряд и становится более отрицательным.
Изоэлектрическая точка (ИЭТ)
Существует определенное значение pH, при котором количество положительно и отрицательно заряженных групп в молекуле белка уравнивается. Это состояние называется изоэлектрической точкой.
В изоэлектрическом состоянии суммарный заряд белка равен нулю. В результате исчезают силы электростатического отталкивания между молекулами, они начинают слипаться друг с другом (агрегировать) и выпадают в осадок. Именно в ИЭТ растворимость белка минимальна.
Яркий пример этого процесса — сворачивание молока. В свежем молоке молекулы белка казеина заряжены отрицательно и образуют устойчивый коллоидный раствор. При размножении бактерий выделяется молочная кислота, которая снижает pH. Когда кислотность достигает изоэлектрической точки казеина (около 4,6), его заряд нейтрализуется, молекулы перестают отталкиваться и молоко сворачивается.
Принципы выделения и очистки белков
Для изучения свойств конкретного белка его необходимо извлечь из клеток и очистить. Стандартный алгоритм включает несколько этапов:
- Разрушение клеток для получения гомогената.
- Фракционирование (центрифугирование) — разделение смеси на ядерную, митохондриальную, цитозольную и другие фракции, чтобы выделить ту, где находится искомый белок.
- Избирательная тепловая денатурация — кратковременное нагревание. Если нужный белок термостабилен, то нагрев заставит термолабильные примеси денатурировать и выпасть в осадок, оставив целевой белок в растворе.
- Высаливание — добавление солей (чаще всего сульфата аммония). Белки с наименьшей растворимостью выпадают в осадок при низких концентрациях соли. Постепенно повышая концентрацию, можно разделить смесь на отдельные фракции.
Разделение белков по массе
Для разделения макромолекул в зависимости от их размера и веса применяют ультрацентрифугирование, электрофорез в полиакриламидном геле и гель-фильтрацию (молекулярно-ситовую хроматографию).
Принцип гель-фильтрации основан на пропускании смеси через колонку с пористыми гранулами. Крупные белки физически не могут проникнуть в поры геля; они проходят в свободном пространстве между гранулами и вымываются из колонки первыми. Мелкие молекулы проникают внутрь пор, их путь сильно удлиняется, поэтому они покидают колонку последними.
Другой важный метод — электрофорез на бумаге, разделяющий белки в электрическом поле. В сыворотке крови здорового человека быстрее всего к аноду движутся альбумины (самая большая фракция, 54–58%). За ними следуют глобулины (альфа-1, альфа-2 и бета). Самой низкой подвижностью обладают гамма-глобулины, образующие катодную фракцию.
Чтобы не путать результаты гель-фильтрации, представьте, что гранулы геля — это дома с узкими дверями. «Толстые» (крупные) молекулы не могут зайти в дом, поэтому быстро пробегают по улице и приходят к финишу первыми. «Худые» (мелкие) молекулы заходят в каждую дверь, долго блуждают по комнатам и приходят последними.
Вопросы с занятий и экзамена
Почему денатурированный белок легче выпадает в осадок?
При денатурации нарушается пространственная структура молекулы, и гидрофобные радикалы аминокислот, которые в норме спрятаны внутри, оказываются на поверхности. Это резко снижает растворимость белка в воде.
Какое значение pH нужно создать, чтобы пептид с зарядом -1 достиг изоэлектрической точки?
Так как заряд пептида отрицательный, его нужно нейтрализовать путем добавления протонов (положительных зарядов). Для этого среду необходимо подкислить, то есть ИЭТ будет находиться в кислой среде (pH < 7).
Что произойдет с зарядом белка при добавлении щелочи?
В щелочной среде присутствует избыток гидроксид-ионов. Они связывают протоны, отнимая их у аминогрупп. В результате положительный заряд белка снижается, и он становится более отрицательным.
Что ещё разобрать по теме
- Правила расчета суммарного заряда пептида по аминокислотным остаткам
- Протеинограмма здорового человека: процентное соотношение фракций
- Принципы электрофореза в полиакриламидном геле (в присутствии ДСН)
- Молекулярные механизмы обратимого высаливания белков
Разберите тему целиком в курсе «Биохимия»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Физико-химические свойства белков» и ещё 3 574 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 115 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Строение, свойства и функции белков»
Бесплатные видеоуроки: биохимияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.