Гель-фильтрация: разделение по молекулярной массе
Данный метод базируется на эффекте молекулярного сита. Суть процесса заключается в просеивании белковых молекул через специализированный носитель — набухшие гранулы сефадекса.
Сам по себе сефадекс представляет собой сложную пространственную структуру. Это трехмерные полисахаридные цепи декстрана, внутри которых сформированы поры определенного диаметра. При пропускании смеси через колонку, скорость продвижения различных белков напрямую зависит от их молекулярной массы.
Разделение происходит по следующему принципу:
- Молекулы с меньшей массой свободно проникают во внутреннее пространство пор гранул сефадекса. Из-за этого их путь удлиняется, они задерживаются в колонке и выходят из нее значительно позже.
- Молекулы с большой массой, напротив, физически не способны попасть внутрь пор декстрана. Они огибают гранулы снаружи и, следовательно, быстрее элюируют (вымываются) с хроматографической колонки.
Ионообменная хроматография: роль электрического заряда
Этот вид фракционирования основан на электростатическом взаимодействии. Процесс протекает за счет связывания ионизированных групп самих белков с противоположно заряженными функциональными группами носителя. В качестве такого носителя выступают ионообменные смолы — особые нерастворимые полимерные материалы.
Ключевое правило метода: прочность адсорбции (связывания белка со смолой) строго пропорциональна величине электрического заряда белковой молекулы. Чем сильнее заряжен белок, тем крепче он фиксируется на полимере.
Для того чтобы снять выделенный белок с колонки, применяется процедура элюции (смывания). Адсорбированные белки вымывают с помощью растворов хлорида натрия (NaCl). Концентрацию соли при этом постепенно повышают. Закономерность элюции такова: чем меньше заряд конкретного белка, тем меньшая концентрация NaCl потребуется для того, чтобы разорвать его связь с ионогенными группами смолы и смыть его в пробирку.
Аффинная хроматография: абсолютная специфичность
Среди всех рассматриваемых подходов аффинная хроматография выделяется как наиболее специфический метод выделения индивидуальных белков. Она позволяет прицельно «вылавливать» нужную макромолекулу из сложнейших смесей.
Механизм этого метода включает несколько последовательных этапов:
- Подготовка носителя: к химически инертному полимеру путем ковалентного связывания прочно присоединяется лиганд — молекула, с которой искомый белок взаимодействует в естественных условиях.
- Пропускание смеси: раствор белков наносится на колонку. В этот момент происходит строго комплементарное связывание нужного белка с закрепленным лигандом.
- Финальный результат: на полимерной колонке адсорбируется исключительно тот белок, который специфичен для данного конкретного лиганда. Все остальные (балластные) белки беспрепятственно проходят насквозь, не задерживаясь.
Чтобы запомнить принцип гель-фильтрации, представьте лабиринт (поры сефадекса): «маленькие» мышки (белки с меньшей массой) забегают в каждую норку и задерживаются, а «большие» слоны (белки с большой массой) не пролезают в двери и бегут по прямому коридору на выход.
Вопросы с занятий и экзамена
Чем вымывают белки при ионообменной хроматографии?
Адсорбированные на ионообменных смолах белки смывают растворами NaCl. При этом используется метод градиента — концентрацию соли постепенно повышают в зависимости от заряда белка.
Какой метод хроматографии считается наиболее специфическим?
Наиболее специфическим методом является аффинная хроматография, так как она основана на комплементарном связывании индивидуального белка с его специфическим лигандом, ковалентно пришитым к полимеру.
Что ещё разобрать по теме
- Трехмерная структура и свойства полисахаридных цепей декстрана.
- Химическая природа нерастворимых ионообменных смол.
- Механизмы ковалентного присоединения лиганда к инертному полимеру.
- Природа комплементарного связывания белка и лиганда.
Разберите тему целиком в курсе «Биохимия»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Хроматография белков» и ещё 3 574 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 115 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Строение, свойства и функции белков»
Бесплатные видеоуроки: биохимияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.