Окраска по Граму: методика, интерпретация и классификация бактерий

В двух словах. Окраска по Граму (1884, Ганс Христиан Грам) — базовый метод классификации бактерий: Грам+ окрашиваются в фиолетовый (толстая клеточная стенка с пептидогликаном удерживает комплекс «генциан-йод»), Грам− — в розовый (тонкий пептидогликан + внешняя мембрана с ЛПС, комплекс вымывается спиртом, докрашивается сафранином/фуксином). За 3–5 мин даёт ориентировку: Грам+ кокки — стафило/стрепто/энтерококки; Грам− палочки — кишечная группа, псевдомонады; Грам+ палочки — клостридии, листерии, бациллы; Грам− кокки — нейссерии. Критично для выбора эмпирической антибиотикотерапии до посева.

1. История и автор

Разработан в 1884 г. датским микробиологом Гансом Христианом Грамом.
Первоначально — для дифференцировки пневмококка от клебсиеллы в препаратах лёгких.
С 1920-х — стандарт в медицинской микробиологии.
Основан на различиях в строении клеточной стенки.

2. Методика (4 этапа)

Этап	Реагент	Время	Результат
1. Первичная окраска	Генциановый/кристаллический фиолетовый	1 мин	Все клетки фиолетовые
2. Протрава	Раствор Люголя (I₂-KI)	1 мин	Формирование комплекса генциан-йод
3. Обесцвечивание	96 % этанол или ацетон	15–30 сек	Грам− теряют краситель; Грам+ удерживают
4. Докрашивание	Сафранин или фуксин Пфейффера	1 мин	Грам− розовые; Грам+ остаются фиолетовыми

Между этапами — промывание дистиллированной водой.
Критично: не передержать на этапе обесцвечивания → ложноотрицательные (Грам+ становятся розовыми).
Материал — нативный (мокрота, моча, ликвор, раневое отделяемое) или с колоний на среде.

3. Строение клеточной стенки

Грам+ бактерии

Толстый слой пептидогликана (20–80 нм).
Тейхоевые и липотейхоевые кислоты.
Нет внешней мембраны.
Пептидогликан-йод-генциановый комплекс крупный, не вымывается спиртом.
Чувствительны к пенициллинам, ванкомицину, лизоциму.

Грам− бактерии

Тонкий слой пептидогликана (2–7 нм).
Внешняя мембрана с липополисахаридом (ЛПС, эндотоксин) и порине.
Периплазматическое пространство между двумя мембранами.
При обработке спиртом липидный слой растворяется → комплекс вымывается.
Устойчивы к ванкомицину (не проникает через внешнюю мембрану).

4. Грам+ бактерии — важнейшие

Род	Вид	Форма	Заболевания
Staphylococcus	S. aureus	Грозди кокков	Пиодермии, сепсис, эндокардит, пневмония
Streptococcus	S. pyogenes (BGA)	Цепочки кокков	Ангина, скарлатина, рожа, острый гломерулонефрит
Streptococcus	S. pneumoniae	Диплококки ланцет.	Пневмония, менингит, отит
Enterococcus	E. faecalis	Диплококки	ИМП, эндокардит
Bacillus	B. anthracis	Палочки	Сибирская язва
Clostridium	C. difficile, tetani, botulinum, perfringens	Анаэроб. палочки	Псевдомембр. колит, столбняк, ботулизм, газовая гангрена
Listeria	L. monocytogenes	Палочки	Листериоз у беременных, новорождённых
Corynebacterium	C. diphtheriae	Палочки	Дифтерия

5. Грам− бактерии — важнейшие

Род	Представители	Заболевания
Enterobacteriaceae	E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Serratia	ИМП, сепсис, пневмония, перитонит
Salmonella	S. typhi, S. enteritidis	Брюшной тиф, сальмонеллёз
Shigella	S. dysenteriae и др.	Шигеллёз
Pseudomonas	P. aeruginosa	Нозокомиальные инфекции, ВАП, ожоговые раны
Acinetobacter	A. baumannii	Нозокомиальные, MDR
Neisseria	N. meningitidis, N. gonorrhoeae	Менингит, гонорея
Haemophilus	H. influenzae	Эпиглоттит, менингит, отит
Bordetella	B. pertussis	Коклюш
Campylobacter	C. jejuni	Энтерит
Helicobacter	H. pylori	Гастрит, язва, рак желудка

6. «Не красятся по Граму»

Микобактерии (M. tuberculosis, M. leprae) — восковая стенка; окраска по Цилю-Нильсену (КУМ).
Микоплазмы (M. pneumoniae) — нет клеточной стенки; не видны при Грам-окраске.
Спирохеты (T. pallidum, Borrelia) — тонкие, плохо красятся; тёмнопольная микроскопия, серебрение.
Хламидии, риккетсии — внутриклеточные паразиты.
Legionella — требует серебрения или специальных сред (BCYE).

7. Клиническое применение

Мокрота — быстрая ориентировка при внебольничной и нозокомиальной пневмонии.
Ликвор — экстренно при менингите: Грам+ диплококки — пневмококк; Грам− диплококки — менингококк; Грам− палочки — H. influenzae.
Моча — при уросепсисе; Грам− палочки — чаще кишечная группа.
Кровь (из флаконов гемокультуры) — при сепсисе.
Раневое отделяемое, гной.
Мазок уретры/цервикса — гонорея (Грам− диплококки внутри нейтрофилов).

8. Эмпирическая антибиотикотерапия

Грам+ кокки в мокроте у внебольничной пневмонии — цефтриаксон ± макролид; вероятен пневмококк.
Грам− палочки в моче — цефтриаксон, фторхинолоны.
Грам+ диплококки в ликворе — цефтриаксон + ванкомицин (пневмококк, возможна резистентность).
Грам− диплококки в ликворе — цефтриаксон (менингококк); изоляция контактных.
Смешанная флора в перитонеальном отделяемом — β-лактам + антианаэробный (метронидазол) или карбапенем.
Анаэробные Грам+ палочки со спорами — заподозрить клостридиальную инфекцию.

9. Ограничения метода

Чувствительность ~60–80 % (для достоверной оценки нужно ≥ 10⁵ клеток в поле зрения).
Качество образца: в мокроте — контроль по критериям (< 10 эпителиальных клеток и > 25 нейтрофилов в поле при ×100).
Не различает жизнеспособные и мёртвые клетки.
Не даёт видовой диагноз (нужен посев + биохимия + масс-спектрометрия MALDI-TOF).
Не заменяет чувствительность к антибиотикам — её определяют только после посева.

10. Ошибки исследования

Передержка в спирте — ложноотрицательные (Грам+ выглядят как Грам−).
Недодержка — ложноположительные.
Старые культуры — Грам+ могут давать грамвариабельную картину (обусл. истончением стенки).
Чрезмерно толстый мазок — плохое обесцвечивание.
Контаминация — множество морфотипов.

11. Современные альтернативы и дополнения

Посев с идентификацией через MALDI-TOF (масс-спектрометрия) — видовой диагноз за 15 мин.
ПЦР-панели (Septi-Fast, FilmArray BCID/GI/RP) — быстрая детекция возбудителей в крови, ликворе, респ. материале.
16S rRNA-секвенирование — идентификация при отрицательном посеве.
Антиген-тесты (пневмококковый, легионеллёзный в моче).
Окраска по Граму остаётся первым скринингом из-за скорости и дешевизны.

12. FAQ

Почему микобактерии не красятся по Граму?
Их клеточная стенка содержит высокомолекулярные миколовые кислоты и воск → гидрофобная поверхность не пропускает водные красители. Используют кислотно-щёлочно-устойчивую окраску (Циль-Нильсен, флюорохром аурамин).

Грамвариабельные — это кто?
Бактерии, которые в разных условиях дают разную картину: старые Грам+ (истончение стенки), некоторые клостридии, листерии. Обычно соответствуют истинным Грам+.

Почему Грам− палочки в моче чаще всего — E. coli?
Кишечная палочка — нормальный комутабитант ЖКТ и основная причина внебольничных ИМП (70–80 %). Это первая гипотеза при появлении Грам− палочек в моче.

Можно ли по Граму различить S. aureus и S. epidermidis?
Нет. Оба — Грам+ кокки в гроздьях. Различают через коагулазу (S. aureus +), каталазу (оба +) и биохимию.

Почему ванкомицин не работает против Грам−?
Ванкомицин — крупная молекула, которая связывается с D-Ala-D-Ala в пептидогликане. У Грам− снаружи есть внешняя мембрана с малыми поринами, через которую ванкомицин не проникает.

Смотрите также: Антибиотики · Сепсис · Менингит · Туберкулёз · Каталог микробиологии

Связанные инструменты: Уроки: Микробиология

Все статьи блога · Каталог предметов · Клинические калькуляторы