Как создают гибридомы
Процесс получения гибридом состоит из нескольких ключевых шагов:
- Иммунизация: Лабораторную мышь иммунизируют нужным антигеном.
- Забор клеток: Из селезенки животного извлекают антителообразующие клетки (спленоциты).
- Гибридизация: Спленоциты сливают со специальными миеломными клетками. Главное требование к миеломной линии — она не должна вырабатывать собственные иммуноглобулины. В результате образуется гетерокарион (клетка с двумя ядрами), а затем — единая гибридная клетка.
- Селекция на среде НАТ: Полученную клеточную смесь помещают на селективную среду для отсеивания неслившихся клеток.
- Клонирование: Клетки, вырабатывающие антитела нужной специфичности, отбирают и размножают. Клональность подтверждают методом изоэлектрофокусирования.
Принцип селекции на среде НАТ
Среда НАТ содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин — это яд, блокирующий основной путь синтеза нуклеотидов в клетке.
В этой среде выживают только гибридомы, так как они сочетают в себе свойства обеих родительских клеток:
- Неслившиеся миеломные клетки погибают. Основной путь у них заблокирован аминоптерином, а ферменты для запасного пути генетически дефектны.
- Неслившиеся спленоциты погибают сами по себе, так как не способны долго жить in vitro.
- Гибридомы выживают. От миеломы они наследуют «бессмертие», а от нормальной клетки — полноценные гены для запасного пути синтеза нуклеотидов с использованием гипоксантина и тимидина.
Гуманизация антител
Так как создавать гибридомы из клеток человека оказалось сложно, а потребность в человеческих моноклональных антителах для терапии высока, применяют генную инженерию.
Процесс «гуманизации» включает замену каркасных участков мышиных генов на гены человека. В итоге от мышиного антитела остаются только гипервариабельные участки, отвечающие за связывание с антигеном, а сама молекула теряет антигенность для иммунной системы человека.
Фаговый дисплей и минимальные антитела
Технология фагового дисплея позволяет создавать антигенсвязывающие молекулы без использования животных:
- Из генов В-лимфоцитов формируют комбинаторную библиотеку Fab-молекул.
- Гены сливают с геном белка оболочки бактериофага.
- С помощью антигена отбирают фаги нужной специфичности, которые затем размножают в бактериях.
Так получают минимальные антигенсвязывающие молекулы: scFv (ковалентно связанные V-домены H- и L-цепей) и мини-тела. Они удобны для создания конъюгатов с лекарствами, токсинами или флуорохромами.
Вопросы с занятий и экзамена
Для чего нужна среда НАТ?
Среда НАТ позволяет убить неслившиеся опухолевые клетки (за счет блокировки путей синтеза нуклеотидов), оставляя в живых только гибридомы, которые получают ферменты для обходного пути от нормального лимфоцита.
В чем суть гуманизации мышиных антител?
Гуманизация — это генно-инженерная замена каркасных участков мышиного антитела на человеческие. От мыши остаются только участки, распознающие антиген, чтобы антитело не вызывало иммунного ответа у человека.
Что такое scFv?
Это минимальная антигенсвязывающая молекула (единая цепь из V-доменов тяжелой и легкой цепей), создаваемая с помощью технологии фагового дисплея.
Что ещё разобрать по теме
- Методы скрининга антител (ИФА, проточная цитометрия)
- Критерии отбора клонов гибридом
- Особенности хранения и наработки моноклональных антител
- Практическое применение минимальных антител в таргетной терапии
- Иммунологическая память и вторичный ответ
Разберите тему целиком в курсе «Иммунология»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Гибридомы и моноклональные антитела» и ещё 723 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 23 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Адаптивный иммунитет»
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.