Репликация ДНК: модели, ферменты и этапы процесса

Модели репликации ДНК

Репликация — процесс образования двух дочерних молекул ДНК из одной родительской. Выделяют три теоретические модели: полуконсервативную, консервативную и дисперсную.

• В полуконсервативной модели каждая дочерняя молекула состоит из одной материнской и одной вновь синтезированной полинуклеотидной цепи.
• В консервативной модели исходная двуспиральная молекула сохраняется целиком, а дочерняя состоит только из новых цепей.
• В дисперсной модели дочерние молекулы содержат чередующиеся фрагменты материнских и новосинтезированных последовательностей.

Для вирусов описаны все три варианта, тогда как у про- и эукариот реализуется только полуконсервативный механизм. Это доказали Мэтью Мезельсон и Франклин Сталь: культуру Escherichia coli выращивали в среде с тяжёлым изотопом азота ¹⁵N, затем переносили в среду с ¹⁴N и анализировали плотность ДНК ультрацентрифугированием в градиенте CsCl. После первого раунда наблюдалась полоса промежуточной плотности, после второго — промежуточная и лёгкая, что подтвердило полуконсервативный механизм.

ДНК-полимеразы прокариот

У прокариот выделяют три основных типа ДНК-полимераз:

• ДНК-полимераза I — удаляет РНК-праймеры благодаря 5′→3′ экзонуклеазной активности и заполняет образовавшиеся пробелы.
• ДНК-полимераза II — участвует в репарации повреждений ДНК.
• ДНК-полимераза III — основной фермент репликации, высокопроцессивный, обеспечивает синтез новой цепи.

ДНК-полимераза III E. coli имеет сложное мультисубъединичное строение:

• α-субъединица — каталитическая, синтез ДНК в направлении 5′→3′.
• ε-субъединица — 3′→5′ экзонуклеазная активность, корректура ошибок.
• θ-субъединица — стабилизация комплекса, поддержка функции ε.
• β-субъединица — образует кольцевую структуру (скользящий зажим) вокруг ДНК, обеспечивая высокую процессивность.
• γ-комплекс — зажим-загрузочный комплекс, гидролизует АТФ, открывает и закрывает β-кольцо.
• τ-субъединица — связывает два каталитических ядра и координирует синтез ведущей и отстающей цепи, взаимодействует с хеликазой.

ДНК-полимеразы эукариот

У эукариот описано пять основных полимераз:

• Полимераза α — работает в комплексе с праймазой; инициирует синтез, наращивая короткий участок ДНК на РНК-праймере.
• Полимераза δ — основной фермент синтеза отстающей цепи; функционирует в комплексе с белком PCNA (пролиферирующий клеточный ядерный антиген), играющим роль скользящего зажима.
• Полимераза ε — синтез ведущей цепи и участие в репарации.
• Полимераза β — эксцизионная репарация оснований.
• Полимераза γ — репликация митохондриальной ДНК.

Теломеры и теломераза

Теломеры — концевые участки линейных хромосом, состоящие из коротких тандемных повторов. У человека повтор имеет последовательность TTAGGG (три гуанина, два тимина и аденин). Теломеры служат площадкой для размещения РНК-затравки и защищают концевые участки от ферментативной деградации.

Проблема концевой репликации возникает потому, что синтез отстающей цепи требует РНК-праймера, а на самом конце линейной молекулы пространства для его посадки не хватает. В результате каждое деление сопровождается потерей короткого фрагмента ДНК на концах хромосом.

Решение — фермент теломераза, обладающий активностью обратной транскриптазы. Он содержит белковый каталитический компонент и встроенную РНК-матрицу, комплементарную теломерному повтору. Теломераза достраивает повторы на 3′-конце; затем эндонуклеазы удаляют избыточную ДНК, формируется характерная Т-петля, в которой 3′-конец заворачивается внутрь двуспиральной структуры, стабилизируя хромосому.

Этапы репликации

Репликация делится на три стадии: инициация, элонгация, терминация.

Инициация

• Распознавание ориджина репликации: у прокариот единственный сайт связывают белки DnaA, у эукариот множественные ориджины распознаёт комплекс ORC при участии регуляторных белков CDC6 и CDT1, лицензирующих репликацию.
• Расплетание двойной спирали хеликазой с образованием репликационной вилки; одноцепочечные участки стабилизируются SSB-белками.
• Синтез РНК-праймеров праймазой; у эукариот праймаза работает в комплексе с полимеразой α.

Элонгация

• Ведущая цепь синтезируется непрерывно в направлении 5′→3′ (у прокариот — Pol III, у эукариот — Pol ε).
• Отстающая цепь синтезируется прерывисто короткими фрагментами Оказаки (Pol III у прокариот, Pol δ у эукариот), каждый из которых начинается со своего РНК-праймера.
• Удаление праймеров и сшивание фрагментов: у прокариот Pol I заполняет пробелы, у эукариот праймеры удаляются и пробелы достраиваются полимеразой δ. ДНК-лигаза ковалентно сшивает фрагменты в непрерывную цепь.

Терминация

• У прокариот репликационные вилки останавливаются на терминальных последовательностях Ter, связанных белком Tus.
• У эукариот вилки сливаются между собой.
• Разделение дочерних молекул обеспечивают топоизомеразы, снимающие суперспирализацию и разводящие сцепленные кольцевые молекулы или сестринские хроматиды.

Эксперименты Оказаки

В 1960–1970-х годах Рэйдзи и Цунэко Оказаки исследовали механизм синтеза ДНК. В среду культивирования E. coli, заражённой бактериофагом T4, вводили радиоактивно меченые предшественники (например, тритий-тимидин). Через короткие промежутки времени ДНК выделяли и разделяли электрофорезом, а распределение меток оценивали авторадиографией.

В импульсных пробах обнаруживались короткоживущие фрагменты длиной около 1000 пар оснований, впоследствии названные фрагментами Оказаки. Они формируются на отстающей цепи, начинаются с РНК-праймера и затем сшиваются в непрерывную цепь. Тем самым была доказана прерывистая природа синтеза одной из цепей при общей непрерывности другой.

Ключевые моменты

• Репликация ДНК у про- и эукариот идёт по полуконсервативной модели, доказанной экспериментом Мезельсона–Сталя.
• У прокариот ключевой фермент — ДНК-полимераза III, а Pol I удаляет праймеры; у эукариот ведущую цепь синтезирует Pol ε, отстающую — Pol δ.
• Высокую процессивность обеспечивают скользящие зажимы: β-кольцо у прокариот и PCNA у эукариот.
• Теломеры защищают концы хромосом, а теломераза с собственной РНК-матрицей решает проблему концевой репликации.
• Этапы репликации: инициация (ориджин, хеликаза, SSB, праймаза), элонгация (ведущая и отстающая цепи), терминация (Ter/Tus, топоизомеразы).
• Отстающая цепь синтезируется фрагментами Оказаки, сшиваемыми ДНК-лигазой.
• Корректирующая 3′→5′ экзонуклеазная активность полимераз обеспечивает высокую точность копирования.
• Эксперименты Оказаки с радиоактивной меткой и электрофорезом доказали прерывистый синтез одной из цепей ДНК.