Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Биохимическая суть реакции

Фермент лактатдегидрогеназа отвечает за протекание обратимой окислительно-восстановительной реакции. В зависимости от текущего метаболического пути (гликолиз или глюконеогенез), процесс может идти как в прямом, так и в обратном направлении.

В качестве субстрата в данной реакции выступает пируват либо лактат. Обязательным участником процесса является кофермент НАД (в формах NAD$^+$ или NADH). Для того чтобы организм мог синтезировать этот кофермент, требуется наличие витамина-предшественника — витамина PP (он же витамин B$_3$, ниацин, никотиновая кислота или никотинамид).

Общее уравнение реакции выглядит следующим образом: Пируват + NADH + H$^+$ ↔ Лактат + NAD$^+$

Источником фермента для проведения лабораторной диагностики служит сыворотка крови пациента, в которой фермент оказывается после естественного обновления клеток или при их разрушении.

Условия проведения лабораторной пробы

Чтобы корректно определить активность фермента in vitro, необходимо создать условия, при которых лактатдегидрогеназа работает максимально эффективно. Эти параметры строго контролируются в ходе эксперимента:

• Температурный режим: обычно поддерживается оптимальная температура для человеческих ферментов, равная 37 °C. В некоторых случаях применяются стандартные лабораторные значения (25 °C или 30 °C).
• Кислотность среды (pH): реакция требует оптимального буферного раствора, который поддерживает pH в диапазоне от 7.4 до 7.8.
• Длительность: время инкубации фиксируется с высокой точностью. В стандартных учебных и лабораторных задачах оно чаще всего составляет ровно 10 минут.

Оценка скорости реакции и расчет активности

Главным параметром, по которому мы можем судить об активности фермента, является скорость протекания реакции. Эту скорость оценивают по изменению количества участников реакции в единицу времени — либо по убыли субстрата, либо по приросту продукта.

В современной лабораторной практике для этих целей широко применяется спектрофотометрия. Измерение изменения оптической плотности раствора проводят при длине волны 340 нм — этот показатель напрямую отражает динамику изменения концентрации кофермента NADH.

Если же оценка производится на основе количества убывшего субстрата, активность фермента (А) рассчитывается в международных единицах на литр (МЕ/л, U/L) по специальной формуле:

$$ A = \frac{\Delta S}{t \cdot V} \cdot 1000 $$

Где:

• $\Delta S$ — количество потребленного субстрата в микромолях (вычисляется как разница между исходным количеством $S_{\text{исх}}$ и оставшимся $S_{\text{ост}}$);
• $t$ — время инкубации, выраженное в минутах;
• $V$ — объем взятой сыворотки в миллилитрах;
• $1000$ — стандартизирующий коэффициент, необходимый для пересчета объема из миллилитров в литры.

Клинический пример: интерпретация результатов

Рассмотрим практическое применение формулы на примере сравнения двух пациентов. В обоих случаях время инкубации составило 10 минут, а объем исследуемой сыворотки — 5 мл. Исходное количество субстрата было равно 40 мкмоль.

Анализ пациента 1:

1. Остаток субстрата составил 31 мкмоль. Находим убыль ($\Delta S$): 40 - 31 = 9 мкмоль.
2. Выполняем расчет активности: $A_1 = \frac{9}{10 \cdot 5} \cdot 1000 = \frac{0.9}{5} \cdot 1000 = 180$ МЕ/л.

Анализ пациента 2:

1. Остаток субстрата составил всего 4 мкмоль. Убыль ($\Delta S$): 40 - 4 = 36 мкмоль.
2. Выполняем расчет активности: $A_2 = \frac{36}{10 \cdot 5} \cdot 1000 = \frac{3.6}{5} \cdot 1000 = 720$ МЕ/л.

Клинический вывод: Результаты показывают, что активность лактатдегидрогеназы у второго пациента (720 МЕ/л) в несколько раз превышает показатели первого пациента (180 МЕ/л). Такое выраженное повышение активности ЛДГ в сыворотке может указывать на наличие патологического процесса, сопровождающегося разрушением клеток, например, на гемолиз, повреждение ткани печени или инфаркт миокарда.

Вопросы с занятий и экзамена

Что ещё разобрать по теме

• Особенности спектрофотометрического метода определения активности ферментов
• Принципы буферных систем и их влияние на pH ферментативных реакций
• Гликолиз и глюконеогенез: роль ЛДГ в регуляции метаболических путей
• Витамины группы B как предшественники важнейших коферментов
• Механизмы выхода внутриклеточных ферментов в плазму крови при некрозе тканей

Другие темы раздела «Энзимология»

Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.