Компоненты реакционной смеси
Для проведения полимеразной цепной реакции требуется собрать специфическую смесь компонентов в одной пробирке.
В первую очередь необходима исходная ДНК-матрица — тот самый материал, который подлежит копированию. В качестве субстратов для синтеза новых цепей используются четыре вида дезоксинуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ). Они играют роль строительных блоков.
Главным катализатором процесса выступает Taq-полимераза — особый термостабильный фермент, который не разрушается при сильном нагревании. Чтобы эта полимераза работала максимально эффективно, в среду добавляют буферный раствор, содержащий ионы магния (Mg²⁺), которые выполняют важнейшую функцию ферментативного кофактора.
Ключевым элементом, задающим специфичность реакции, являются два праймера. Это искусственно созданные короткие однонитевые молекулы ДНК, длина которых составляет от 20 до 30 нуклеотидов. Их главная задача — служить «затравками» для начала ферментативного синтеза. Праймеры строго комплементарны 3'-концевым последовательностям амплифицируемого участка, расположенным на обеих нитях матричной ДНК. Концентрация праймеров в смеси должна многократно превышать количество исходной матрицы, а расстояние между ними в итоге определяет точную длину новых синтезируемых фрагментов.
Этапы одного цикла ПЦР
Весь процесс протекает в специальном автоматизированном приборе, который называется амплификатором (или термоциклером). Этот аппарат циклически меняет и поддерживает заданные температуры, полностью автоматизируя реакцию. Один температурный цикл длится от 1 до 2 минут и включает три последовательных этапа:
- Денатурация (нагревание до 94 °C). Под воздействием высокой температуры происходит разрушение водородных связей двухцепочечной спирали ДНК. Исходная молекула расплетается, и ее цепи (3'—5' и 5'—3') полностью расходятся в стороны.
- Отжиг (52–60 °C). Англоязычный термин — annealing. Температура внутри прибора снижается, что позволяет коротким праймерам найти свои мишени и комплементарно связаться с соответствующими участками на нитях матричной ДНК.
- Полимеризация или элонгация (72 °C). Аппарат вновь повышает температуру до уровня, который является самым оптимальным для работы термостабильной ДНК-полимеразы. Фермент прикрепляется к зоне посадки праймера и начинает синтезировать новую цепь, последовательно достраивая ее с 3'-конца.
Динамика и возможности метода
Эффективность полимеразной цепной реакции основана на принципе экспоненциального роста. Во время самого первого цикла происходит образование лишь первых копий заданного участка ДНК. На втором цикле аппарат повторяет фазы денатурации, отжига и элонгации, в результате чего количество фрагментов ДНК удваивается. Начиная с 3-го и вплоть до 20-го цикла, наблюдается стремительный экспоненциальный рост количества копий. Всего за 20 циклов в пробирке образуется более одного миллиона ($10^6$) копий ПЦР-продукта. Использование автоматического термоциклера позволяет получить это огромное количество исследуемой ДНК всего за 1–2 часа.
В современной биологии и медицине этот метод позволяет решать огромный спектр задач. ПЦР широко используется для идентификации различных мутаций непосредственно в структуре ДНК. Метод позволяет амплифицировать целевой участок для проведения любых дальнейших исследований.
В медицинской диагностике ПЦР незаменима для выявления чужеродных генов при инфицировании организма патогенными вирусами и бактериями. Кроме того, технология активно применяется для установления генетического родства между организмами и даже для определения принадлежности конкретного гена к эухроматину или гетерохроматину.
Аббревиатура этапов: ДОЭ — Денатурация (разрушение спирали), Отжиг (посадка праймеров), Элонгация/полимеризация (синтез цепи).
Вопросы с занятий и экзамена
В чем заключается функция Taq-полимеразы?
Это термостабильный фермент, который удлиняет новые цепи ДНК, начиная с 3'-конца праймеров. Благодаря своей устойчивости он не разрушается при высокой температуре во время денатурации.
Зачем в реакционной смеси нужны ионы магния (Mg²⁺)?
Ионы магния входят в состав буфера и выполняют роль обязательного кофактора, необходимого для правильной и эффективной работы ДНК-полимеразы.
Что определяет длину копируемого фрагмента ДНК?
Длина синтезируемого участка строго зависит от расстояния между двумя праймерами, которые комплементарно связываются с противоположными нитями ДНК-матрицы.
Сколько времени занимает получение миллионов копий?
Благодаря термоциклеру один цикл занимает 1–2 минуты, а весь процесс амплификации, дающий более миллиона копий (около 20 циклов), завершается за 1–2 часа.
Что ещё разобрать по теме
- Механизм комплементарного связывания праймеров с матрицей.
- Роль ионов магния и других кофакторов в ферментативном катализе.
- Отличия в структуре и функциях эухроматина и гетерохроматина.
- Виды дезоксинуклеозидтрифосфатов и их участие в синтезе ДНК.
- Принципы автоматизации генетических исследований с помощью термоциклеров.
Разберите тему целиком в курсе «Биохимия»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Полимеразная цепная реакция» и ещё 3 574 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 115 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Матричные биосинтезы»
Бесплатные видеоуроки: биохимияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.