Общий принцип и механизм реакции
В иммуноферментном анализе (ИФА) ключевую роль играет конъюгат — антитела, к которым химическим путем присоединен фермент. Чаще всего в качестве меток используются пероксидаза хрена, $\beta$-галактозидаза или щелочная фосфатаза.
Реакция протекает в несколько этапов:
- Формирование иммунного комплекса «антиген-антитело».
- Добавление специального субстрата или хромогена.
- Фермент, находящийся в конъюгате, расщепляет субстрат.
- В результате расщепления меняется цвет раствора.
Интенсивность появившейся окраски напрямую зависит от количества связавшихся молекул. Это позволяет проводить количественную оценку анализируемого вещества. Для того чтобы остановить реакцию в нужный момент, в смесь добавляют кислоту, которая денатурирует фермент.
Твердофазный ИФА (ELISA)
Наибольшее распространение получил твердофазный ИФА (ELISA). Его главная особенность — один из компонентов (антиген или антитело) заранее прикреплен (сорбирован) на твердом носителе. Обычно роль носителя выполняют лунки полистироловых планшетов.
Важнейшим условием успешного проведения твердофазного ИФА является тщательное промывание лунок планшета после каждого добавления нового реагента. Это необходимо для полного удаления всех несвязавшихся молекул, чтобы предотвратить появление ложноположительных результатов.
Основные варианты ИФА
В зависимости от целей диагностики применяют разные схемы анализа:
- Определение антител (серодиагностика): Цель — найти специфические иммуноглобулины к возбудителю в сыворотке пациента. На дне лунки фиксируют известный антиген. При добавлении сыворотки больного его антитела (если они есть) связываются с антигеном. Затем добавляют конъюгат (антиглобулиновую сыворотку с ферментом), который цепляется к Fc-фрагментам антител больного. Добавление субстрата вызывает окрашивание.
- Определение антигенов («сэндвич-метод»): Используется для поиска самого возбудителя или его частиц. В лунке закреплены диагностические антитела. Они «захватывают» искомый антиген из сыворотки пациента. После этого вносят меченые антитела против того же антигена, которые замыкают комплекс («сэндвич»). Наличие фермента подтверждается цветной реакцией.
- Конкурентный ИФА: Метод основан на соревновании молекул за ограниченное число мест связывания. Например, при поиске антигена искомый антиген пациента и добавленный меченый стандартный антиген конкурируют за связь с антителами.
Применение в клинической практике
Благодаря своей высочайшей чувствительности (выявление концентраций до $10^{-10}$ — $10^{-12}$ г/л), ИФА широко применяется в современной медицине.
Основные сферы использования:
- Диагностика инфекционных заболеваний: вирусных (включая гепатит В и ВИЧ), бактериальных, паразитарных.
- Количественное определение биологически активных молекул, таких как гормоны и ферменты.
- Мониторинг концентрации лекарственных препаратов в организме.
Чтобы запомнить суть сэндвич-метода, представьте бутерброд: нижний кусок хлеба — это закрепленные антитела на дне лунки, начинка (мясо) — искомый антиген из крови пациента, а верхний кусок хлеба — добавленные меченые антитела, которые закрывают конструкцию.
Вопросы с занятий и экзамена
Что такое конъюгат в ИФА?
Конъюгат — это антитела, прочно связанные (конъюгированные) с молекулой фермента, который служит меткой для последующей визуализации реакции.
В чем разница между прямым и непрямым методом выявления?
Схема с поиском антител в сыворотке (серодиагностика) является непрямым методом, так как ферментная метка находится на вторичных (антиглобулиновых) антителах, а сэндвич-метод направлен на поиск антигенов.
Что ещё разобрать по теме
- Подробный механизм работы пероксидазы хрена
- Причины ложноположительных и ложноотрицательных результатов ИФА
- Спектрофотометрия: как приборы считывают интенсивность окраски
- Особенности ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции
- Сравнение ИФА с ПЦР-диагностикой
Разберите тему целиком в курсе «Микробиология»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Иммуноферментный анализ» и ещё 4 383 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 141 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Иммунодиагностические реакции»
Бесплатные видеоуроки: микробиологияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.