Основы иммунодиагностики

Механизм взаимодействия антигена и антитела

Любая иммунодиагностическая реакция in vitro протекает в две последовательные фазы:

1. Специфическая фаза. Происходит быстро и невидима невооруженным глазом. Механизм заключается в связывании активного центра (Fab-фрагмента) антитела с детерминантой (эпитопом) антигена. Взаимодействие обеспечивается физико-химическими силами: водородными связями, ван-дер-ваальсовыми силами и гидрофобными взаимодействиями. Эффективность зависит от аффинности (сродства антитела к эпитопу) и авидности (итоговой прочности связи).
2. Неспецифическая фаза. Более медленный этап, который требует наличия электролитов и оптимального уровня pH. Именно в этой фазе результат реакции становится видимым физически — например, в виде помутнения или образования хлопьев (феномен агглютинации).

Стратегия серологического метода

Серологический метод направлен на постановку диагноза путем выявления антител или антигенов в сыворотке крови пациента. Поскольку в реакции один компонент всегда известен, а второй ищется, возможны два варианта:

• Серодиагностика (поиск антител). В качестве «наживки» используются известные антигены — диагностикумы. Если в сыворотке больного есть специфические антитела, они свяжутся с диагностикумом.
• Идентификация (поиск антигена). Для определения видовой или типовой принадлежности выделенного от пациента микроорганизма используют иммунные диагностические сыворотки. Их получают путем гипериммунизации лабораторных животных (например, кроликов), поэтому они гарантированно содержат нужные антитела.

Реакция агглютинации: этапы и варианты

Агглютинация применяется для склеивания корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов).

Этап А: Ориентировочная реакция. Проводится на предметном стекле для предварительного определения вида бактерии. Каплю диагностической сыворотки в низком разведении (1:10 или 1:20) смешивают с чистой культурой возбудителя. Появление хлопьевидного осадка говорит о положительном результате. Обязателен контроль: физраствор плюс культура (чтобы исключить спонтанную агглютинацию).

Этап Б: Развернутая реакция. Выполняется в пробирках для подтверждения специфичности и определения титра. Сыворотку последовательно разводят (титруют) и добавляют взвесь возбудителя. Положительной считается реакция, при которой количество осадка и просветление жидкости наблюдаются в разведении, близком к паспортному значению (титру) сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). В качестве носителей используются эритроциты барана (или латекс).

• Классическая РНГА: на эритроцитах адсорбированы антигены (антигенный диагностикум). Применяется для поиска антител при инфекциях.
• РОНГА (обратная): на эритроцитах адсорбированы антитела. Ищет антигены (например, ботулотоксин) или гормоны (хорионический гонадотропин в тестах на беременность).

Учет результатов РНГА: положительная реакция выглядит как «зонтик» (эритроциты выстилают дно лунки, край фестончатый). Отрицательная — как компактная «пуговка» в центре.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Сложная двухфазная реакция. Перед постановкой сыворотку пациента обязательно прогревают при 56 °C, чтобы инактивировать собственный комплемент, иначе он исказит результаты.

1. Основная фаза. Инкубируются три компонента: антиген, антитело и строго дозированный экзогенный комплемент. Если Аг и Ат подходят друг другу, образуется иммунный комплекс, который связывает (расходует) весь добавленный комплемент.
2. Индикаторная фаза. В систему добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка с антителами к ним). Цель — визуализировать наличие свободного комплемента.

Интерпретация:

• Положительно (+): В первой фазе комплемент связался с иммунным комплексом. Для второй фазы его не осталось. Гемолиза нет, эритроциты оседают на дно.
• Отрицательно (–): В первой фазе комплекс не возник, комплемент остался свободным. Во второй фазе он атакует эритроциты, формируя мембраноатакующий комплекс. Происходит гемолиз — жидкость становится прозрачно-красной («лаковая кровь»). Исторический пример такого метода — диагностика сифилиса (реакция Вассермана).

Твердофазные методы и иммунодиффузия

Помимо классических реакций, активно применяются методы с использованием ферментных меток и диффузии в геле.

• Определение антител (серодиагностика): В лунках на твердой фазе сорбирован известный антиген. Добавляют исследуемую сыворотку, затем — антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом. После внесения хромогенного субстрата наличие антител подтверждается изменением цвета.
• Определение антигенов: На носителе зафиксированы антитела. После добавления материала искомую структуру выявляют иммунной сывороткой с ферментом и субстратом.
• Радиальная диффузия: Проводится в агаровом геле, содержащем эритроциты барана и комплемент. В лунки вносят гемолитическую сыворотку. Антитела диффундируют радиально, образуя видимую зону гемолиза вокруг лунки.

Вопросы с занятий и экзамена

Что ещё разобрать по теме

• Структура и функции Fab-фрагмента антитела
• Природа физико-химических взаимодействий (ван-дер-ваальсовы силы, гидрофобные связи) в специфической фазе
• Приготовление и стандартизация эритроцитарных диагностикумов для РНГА и РОНГА
• Механизм формирования мембраноатакующего комплекса при гемолизе
• Оценка активности комплемента и гемолитической сыворотки

Другие темы раздела «Иммунодиагностические реакции»

Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.