Радиоиммунный анализ (РИА)
Радиоиммунный метод базируется на высокочувствительной реакции связывания антигена с антителом. Роль индикаторной метки здесь играют радионуклиды — чаще всего используются изотопы йода, углерода или трития.
Технически процесс исследования сводится к разделению сформировавшегося радиоактивного иммунного комплекса и последующему измерению уровня бета- или гамма-излучения с помощью специального счетчика. Интенсивность зафиксированного радиационного излучения находится в прямой математической зависимости от числа связавшихся молекул.
Существует два основных варианта постановки реакции:
- Твердофазный РИА. Один из реагирующих компонентов (антиген или антитело) предварительно сорбируется на твердом носителе, например, в лунках полистироловой панели.
- Конкурентный РИА. Применяется для точного количественного подсчета. Искомый антиген из пробы пациента и добавленный стандартный меченый антиген соревнуются за ограниченный пул антител.
Метод обладает колоссальной чувствительностью, улавливая минорные концентрации веществ, однако представляет определенную экологическую опасность из-за необходимости работы с источниками радиации. С его помощью в лабораториях определяют уровни гормонов, ферментов, лекарственных препаратов, иммуноглобулинов и микробных антигенов.
Иммуноблоттинг (Вестерн-блот)
Иммуноблоттинг, также известный как Western Blot, представляет собой комплексный диагностический подход, объединяющий возможности электрофореза, переноса фракций и иммуноферментного (или радиоиммунного) анализа. Это незаменимый инструмент для подтверждающей диагностики, классическим примером которой служит верификация ВИЧ-инфекции.
Исследование проходит в три последовательных этапа:
- Электрофорез. Антигены возбудителя разделяют в полиакриламидном геле под воздействием электрического тока. Фракции распределяются строго в зависимости от их молекулярной массы и заряда.
- Блоттинг (перенос). Разделенные антигены реплицируются из геля на нитроцеллюлозную мембрану. При этом сохраняется точное топографическое расположение невидимых полос (блотов).
- Проявление. На диагностическом этапе используются готовые коммерческие стрипы (полоски) с нанесенными блотами. На них наносят исследуемую сыворотку пациента. Если в крови присутствуют специфические антитела, они связываются с антигенами. После отмывки несвязавшихся элементов добавляют вторичные антивидовые антитела (против иммуноглобулинов человека), несущие ферментную метку. Внесение хромогена вызывает изменение окраски субстрата, и на мембране визуализируются четкие полосы.
Иммунная электронная микроскопия
Этот метод изящно комбинирует разрешающую способность электронной микроскопии со специфичностью серологических реакций. Основное предназначение метода — детальное визуальное изучение микроорганизмов, преимущественно вирусов.
При обработке вирусных частиц специфической иммунной сывороткой происходит формирование крупных иммунных агрегатов. Антитела плотно окружают вирионы, создавая вокруг них своеобразный белковый «венчик». Этот слой обеспечивает выраженное электронно-оптическое контрастирование, благодаря чему вирусные частицы и их скопления становятся отчетливо видимыми.
Для дополнительного усиления видимости применяют маркировку электронно-плотными метками. В частности, антитела конъюгируют с ферритином — особым железосодержащим белком, который отлично задерживает пучок электронов и помогает локализовать искомые антигены.
Проточная цитометрия
Проточная цитометрия — это инструментальный метод анализа клеточных популяций, дифференцировки клеток крови и их идентификации по поверхностным CD-антигенам.
Перед началом анализа суспензию клеток специфически окрашивают моноклональными антителами, которые предварительно помечены флюорохромами. В самом цитометре реализован принцип гидродинамической фокусировки: клетки выстраиваются в капилляре в один ряд и пересекают зону лазерного облучения строго по одной.
Лазер выполняет две ключевые задачи:
- Оценка морфологии. Детектор прямого светорассеяния фиксирует размер и внутреннюю гранулярность проходящей клетки.
- Оценка маркеров. Лазер возбуждает свечение прикрепленных флюорохромных меток. Интенсивность флюоресценции отражает плотность CD-антигенов на мембране.
Сложная оптическая система аппарата использует дихроичные зеркала, чтобы разделить испускаемый свет по длинам волн (например, зеленый спектр 530–550 нм и красный 560–580 нм). Направленный на фотоумножители сигнал преобразуется в графическую гистограмму.
| Направление диагностики | Что конкретно оценивается методом |
|---|---|
| Клеточный профиль | Количественное содержание популяций лимфоцитов |
| Функциональная активность | Фагоцитоз и активность NK-клеток (естественных киллеров) |
| Цитокиновый статус | Уровень продукции различных цитокинов |
| Жизнеспособность | Особенности клеточной гибели (апоптоз, пироптоз) |
Что ещё разобрать по теме
- Механизмы апоптоза и пироптоза, оцениваемые при проточной цитометрии
- Спектр CD-антигенов и их роль в идентификации лимфоцитов
- Специфические белковые полосы (блоты), имеющие значение при диагностике ВИЧ-инфекции
- Физические принципы работы фотоумножителей в лазерной цитофлуорометрии
- Изотопы, используемые в радиоиммунном анализе, и их физиологическая безопасность
Разберите тему целиком в курсе «Микробиология»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Современные методы иммунодиагностики» и ещё 4 383 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 141 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Иммунодиагностические реакции»
Бесплатные видеоуроки: микробиологияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.