Цитопатогенное действие (ЦПД) и внутриклеточные включения
Одним из главных доказательств репродукции вируса являются видимые под микроскопом изменения инфицированных клеток. Характер цитопатогенного действия специфичен для разных групп вирусов, что позволяет проводить их ориентировочную идентификацию.
Выделяют следующие варианты ЦПД:
- Деструкция — наиболее выраженное повреждение. Включает вакуолизацию цитоплазмы, разрушение митохондрий, округление клеток. В итоге они открепляются от стекла и погибают.
- Образование симпластов — слияние мембран соседних клеток с формированием гигантских многоядерных структур.
- Пролиферация — временное разрастание клеточной массы, которое впоследствии все равно заканчивается деструкцией.
Своеобразным проявлением ЦПД является формирование внутриклеточных включений. Это могут быть скопления самих вирусных частиц (вирионов), их отдельных компонентов (белков или нуклеиновых кислот) либо реактивно измененный клеточный материал («клеточные кладбища»).
Включения имеют размеры от 0,2 до 25 мкм, могут быть округлыми или неправильной формы, одиночными и множественными. Их выявляют с помощью световой микроскопии (при окраске анилиновыми красителями) или люминесцентной микроскопии (окраска флюорохромами).
Диагностическое значение имеет локализация включений:
- Цитоплазматические — характерны для вируса натуральной оспы (тельца Гварниери) и вируса бешенства (тельца Бабеша—Негри).
- Внутриядерные — наблюдаются при инфицировании герпесвирусами и аденовирусами.
Метод «бляшек» (негативных колоний)
Метод бляшек применяется не только для индикации, но и для количественного учета, а также дифференциации вирусов. «Бляшки» представляют собой ограниченные очаги разрушенных клеток в монослое. Визуально они выглядят как светлые пятна на сплошном фоне окрашенных живых клеток.
Технически метод реализуется путем добавления агара в питательную среду над монослоем клеток. Агар выступает физическим барьером: он ограничивает свободную диффузию вируса. В результате новое поколение вирионов заражает исключительно соседние клетки.
В основе метода лежит принцип клонирования — каждая бляшка образуется в результате размножения одного исходного вириона. Это позволяет:
- Определять концентрацию: подсчет количества негативных колоний дает возможность вычислить титр вируса в материале.
- Дифференцировать возбудителей: вирусы образуют бляшки, отличающиеся по срокам появления, форме и размеру.
- Проводить селекцию: из одной бляшки можно выделить потомство и получить чистые линии (штаммы) вирусов.
Взаимодействие с эритроцитами
Многие вирусы обладают поверхностными белками — гемагглютининами. Они способны взаимодействовать с рецепторами на мембранах эритроцитов человека, птиц или млекопитающих. На этом свойстве основаны два метода индикации:
- Реакция гемадсорбции. Инфицированные клетки меняют свойства своей поверхности и приобретают способность фиксировать (адсорбировать) эритроциты прямо на своей клеточной мембране. Это характерно для вирусов гриппа и парагриппа. Ценность метода в том, что он позволяет обнаружить вирус даже тогда, когда разрушение клеток (ЦПД) еще не наступило.
- Реакция гемагглютинации (РГА). Схожий механизм, но направленный на выявление уже вышедших из клеток вирусов в культуральной жидкости. Вирусные частицы склеивают (агглютинируют) добавленные эритроциты между собой.
«Цветная» реакция (метод цветной пробы)
Этот метод позволяет зафиксировать факт вирусной репродукции без микроскопирования, ориентируясь на изменение pH питательной среды. В среду предварительно добавляется специальный индикатор.
Отрицательный результат (вируса нет): Здоровые клетки активно метаболизируют питательные вещества. В процессе их жизнедеятельности в среду выделяются кислые продукты обмена. Это приводит к закислению среды (снижению pH), в результате чего цвет индикатора изменяется.
Положительный результат (вирус размножается): Вирусная инфекция подавляет нормальный клеточный метаболизм и приводит к гибели клеток. Поскольку клетки мертвы, кислые продукты не выделяются, pH остается на исходном уровне. В итоге питательная среда сохраняет первоначальный цвет индикатора, что и служит сигналом об успешной индикации вируса.
Для запоминания основных методов индикации можно использовать фразу: «Цветная Бляшка Включает Гемо-ЦПД» (Цветная проба, Бляшки, Включения, Гемагглютинация/Гемадсорбция, Цитопатогенное действие).
Вопросы с занятий и экзамена
В чем разница между гемагглютинацией и гемадсорбцией?
При гемадсорбции эритроциты прилипают к поверхности инфицированных вирусом клеток монослоя. При гемагглютинации вирусные частицы, свободно плавающие в культуральной жидкости, склеивают эритроциты между собой.
Почему сохранение цвета в «цветной» пробе говорит о наличии вируса?
Размножающийся вирус убивает клетки, останавливая их метаболизм. Из-за этого они перестают выделять кислые продукты обмена, pH не падает, и цвет индикатора остается неизменным.
Зачем в методе бляшек используется агаровое покрытие?
Агар блокирует свободное распространение вирусных частиц по всей жидкой среде. Благодаря этому потомство вируса может заражать только строго соседние клетки, формируя ограниченный очаг разрушения — бляшку.
Что ещё разобрать по теме
- Особенности применения флюорохромов при люминесцентной микроскопии включений
- Механизмы формирования клеточных симпластов
- Специфичность гемагглютининов к эритроцитам разных видов животных
- Техника получения чистых линий вирусов из бляшек
- Отличия внутриядерных включений аденовирусов и герпесвирусов
Разберите тему целиком в курсе «Микробиология»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Индикация вирусов» и ещё 4 383 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 141 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Физиология микробов»
Бесплатные видеоуроки: микробиологияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.