Базовые принципы и условия культивирования
Для выращивания культур чаще всего выбирают эмбриональные или опухолевые (злокачественно перерожденные) ткани. Их главное преимущество перед нормальными клетками взрослого организма — высокая способность к активному росту и делению.
Чтобы культура успешно росла вне организма, требуется строгое соблюдение пяти ключевых параметров:
- Асептика. Абсолютное соблюдение стерильности на всех этапах работы.
- Лабораторная посуда. Применяется исключительно химически нейтральное стекло (матрасы, пробирки, флаконы) или специализированные промышленные биореакторы.
- Питательные среды. Клетки нуждаются в сложных многокомпонентных смесях. Обычно используют среду 199 или среду Игла. В их состав входят аминокислоты, витамины, минеральные соли, глюкоза и сыворотка крови. Для стабилизации уровня pH обязательно добавляют буферные растворы.
- Антибактериальная защита. В питательную среду вносят антибиотики. Это необходимо для подавления роста случайной посторонней микрофлоры, которая может погубить культуру.
- Температурный режим. Осуществляется термостатирование строго в диапазоне 36–38,5 °C.
Типы культур клеток по способу роста
В зависимости от организации ткани и характера взаимодействия клеток со средой выделяют три основные формы:
- Однослойные (монослойные) культуры. Клетки плотно прикрепляются к поверхности химически нейтрального стекла и размножаются, образуя сплошной слой толщиной ровно в одну клетку. Это наиболее востребованный и часто применяемый метод в практической вирусологии.
- Суспензионные культуры. Клетки не прикрепляются к стенкам, а свободно плавают и размножаются во всем объеме жидкой питательной среды. Для обеспечения доступа к питанию и адекватной аэрации требуется постоянное перемешивание жидкости (с помощью магнитных мешалок или во вращающихся барабанах). Этот тип идеален для промышленного получения биомассы, например, при производстве вирусных вакцин.
- Органные культуры. В данном случае используются не отдельные клетки, а цельные фрагменты тканей и органов. Главная особенность метода — сохранение исходной архитектуры ткани. Однако из-за сложности поддержания жизнеспособности применение этого типа крайне ограничено.
Классификация культур по числу генераций (пассажей)
Жизнеспособность клеток в лаборатории оценивается по количеству возможных пересевов, которые они способны выдержать.
1. Первичные (первично-трипсинизированные) культуры Их получают из опухолевых, нормальных или эмбриональных тканей. Для этого исходный материал обрабатывают протеолитическими ферментами (чаще всего трипсином). Фермент разрушает межклеточные связи и позволяет получить взвесь полностью изолированных клеток. Главный минус таких культур — крайне ограниченная жизнеспособность: они выдерживают всего от 5 до 10 пассажей (генераций).
2. Перевиваемые (стабильные) культуры Происходят из тканей с экстремально высоким потенциалом роста — эмбриональных или опухолевых. Способны жить в лаборатории неограниченно долго (десятки лет) и выдерживать бесчисленное множество пересевов.
- Преимущества: экономичность, низкая трудоемкость, высокая скорость размножения, возможность длительно хранить в замороженном виде и стандартизировать процессы (используются единые международные линии по всему миру).
- Недостатки: клетки имеют злокачественный характер и накапливают соматические мутации в процессе множественных пассажей. Из-за выраженного онкогенного потенциала их строго запрещено применять для производства вакцин.
3. Полуперевиваемые культуры Занимают промежуточное положение. Чаще всего их получают из эмбриональных тканей человека. Они обладают большей жизнеспособностью, чем первичные (выдерживают 40–50 пассажей), но не являются бессмертными. Их главная генетическая особенность — сохранение диплоидного набора хромосом, типичного для нормальных соматических клеток, и отсутствие злокачественной трансформации. Благодаря своей безопасности они широко используются как для диагностики, так и для производства вакцин.
Значение метода для вирусологии
Внедрение клеточных культур стало по-настоящему революционным этапом в развитии науки:
- Идентификация. Метод позволил ученым выделить и описать огромное количество ранее неизвестных науке вирусов.
- Специфичность. Исследователи получили возможность точно подбирать наиболее чувствительные клеточные линии для культивирования конкретных видов вирусов.
- Глубина исследований. Стало возможным детальное изучение процессов взаимодействия вируса и живой клетки на тонком молекулярном уровне.
Для запоминания классификации по пассажам (числу пересевов): Первичные (только начали, 5–10 пассажей, нужен трипсин), Полуперевиваемые (половина пути, 40–50 пассажей, безопасны для вакцин), Перевиваемые (переживут всех, бесконечные пассажи, но опухолевые и мутировавшие).
Вопросы с занятий и экзамена
Почему для производства вакцин запрещено использовать перевиваемые культуры клеток?
Перевиваемые линии происходят из злокачественных тканей и в процессе бесконечных пассажей накапливают соматические мутации. Из-за этого они обладают онкогенным потенциалом и не могут считаться безопасными для человека.
Зачем при получении первичных культур используют фермент трипсин?
Трипсин — это протеолитический фермент, который расщепляет белки. Он необходим для разрушения прочных межклеточных связей в исходном фрагменте ткани, чтобы получить взвесь отдельных, изолированных друг от друга клеток.
Чем суспензионные культуры отличаются от монослойных?
В монослойных культурах клетки размножаются только прикрепившись к поверхности стекла в один слой. В суспензионных культурах клетки находятся во взвешенном состоянии во всем объеме жидкой среды, что требует постоянного перемешивания для обеспечения их кислородом и питанием.
Что ещё разобрать по теме
- Подробный состав и назначение компонентов среды 199 и среды Игла
- Молекулярные механизмы взаимодействия вируса с восприимчивой клеткой
- Технологии промышленного получения вирусных вакцин в биореакторах
- Криоконсервация: правила длительного хранения перевиваемых линий в замороженном виде
Разберите тему целиком в курсе «Микробиология»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Культуры клеток в вирусологии» и ещё 4 383 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 141 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Физиология микробов»
Бесплатные видеоуроки: микробиологияКороткие уроки с конспектами — без регистрации.
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.