Проточная цитофлуориметрия

Иммунофенотипирование субпопуляций лимфоцитов

Идентификация клеток основана на выявлении специфических маркерных антигенов с использованием меченных флуорохромами антител.

• Т-лимфоциты: подсчет суммарной популяции осуществляется по моноклональным антителам к CD3 — абсолютному маркеру Т-клеток. Субпопуляции CD4+ и CD8+ выявляют параллельно с CD3, используя флуорохромы с контрастным свечением (зеленый, оранжевый, розовый), так как эти рецепторы могут экспрессироваться и на других клетках.
• В-лимфоциты: идентифицируются с помощью антител к CD19 (присутствует на всех В-клетках). Для оценки моноклональности при лимфопролиферативных процессах дополнительно исследуют мембранные $\kappa$- и $\lambda$-цепи.

Оценка пролиферативной активности и клеточного цикла

Функциональную способность Т-клеток оценивают по их поликлональному пролиферативному ответу на митогены. В современной практике для стимуляции используют моноклональные антитела к CD3 (соединенные с пластиком) в сочетании с растворимыми антителами к костимулирующей молекуле CD28.

Для измерения пролиферации и параметров клеточного цикла применяют следующие подходы:

1. Проточная цитометрия с меткой CFSE: краситель Carboxyfluorescein succinyl ester связывается с белками внутри клетки и равномерно распределяется между дочерними структурами при митозе. На цитограмме крайний правый пик формируют неделившиеся клетки, а пики со смещением вправо-налево отражают популяции, прошедшие 1, 2, 3 и более делений.
2. Радиоизотопный метод: измерение включения $^3$H-тимидина служит эталоном по чувствительности, однако связано с неудобствами использования радионуклидов.
3. Оценка клеточного цикла: окрашивание пропидия йодидом с помощью специализированного ПО позволяет рассчитать долю клеток с гипердиплоидным содержанием ДНК в фазах G1+S, G2 и в митозе.

Лабораторная диагностика апоптоза

Анализ программной гибели лимфоцитов проводится двумя цитофлуориметрическими методами:

• Окрашивание пропидия йодидом: в ходе апоптоза теряется часть ядерного материала, поэтому гипнущие клетки образуют характерный гиподиплоидный пик, который на гистограмме располагается левее диплоидного.
• Связывание с аннексином V: меченый аннексин V селективно связывается с фосфатидилсерином, выходящим на наружную поверхность клеточной мембраны исключительно при апоптозе.

Функциональный анализ Т-хелперов (Th1 и Th2) и ELISPOT

Оценка способности Т-хелперов продуцировать цитокины требует внутриклеточного окрашивания и включает последовательные этапы:

1. Активация: клетки стимулируют комбинацией форболмиристат ацетата (активатор протеинкиназы C) и иономицина (кальциевый ионофор) в обход антигенных рецепторов.
2. Блокада секреции: краситель брефелдин А нарушает внутриклеточный транспорт в аппарате Гольджи, сохраняя цитокины внутри.
3. Пермеабилизация и окрашивание: мембрану обрабатывают сапонином, после чего вводят антитела к цитокинам. Ключевой маркер Th1 — IFNγ, для Th2 — IL-4.

Для количественного учета секретирующих цитокины клеток (преимущественно IFNγ-продуцентов Th1) также применяется метод ELISPOT (Enzyme-linked immunospot). В нем клетки инкубируют на нитроцеллюлозной мембране с антителами, фиксируя выделяемый цитокин с помощью иммуноферментного анализа.

Вопросы с занятий и экзамена

Что ещё разобрать по теме

• Использование мембранных kappa- и lambda-цепей для оценки моноклональности В-клеток
• Сравнительный анализ радиоизотопного метода (3H-тимидин) и метки CFSE
• Оценка реактивности клеточных клонов в тесте торможения миграции лейкоцитов
• Детальный алгоритм проведения и детекции результатов метода ELISPOT

Другие темы раздела «Иммунитет в защите и повреждении организма. Патология иммунитета»

Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.