Конкурентный вариант ИФА
Этот тип анализа применяется, когда главной целью является обнаружение антител к заранее известным антигенам.
В основе механизма лежит принцип прямой конкуренции. На твердой фазе (пластике) сорбирован антиген. За право связаться с ним борются два типа антител: искомые (из сыворотки пациента, они не имеют метки) и специально добавленные меченые антитела.
Оценка результатов здесь имеет обратную зависимость: мерой концентрации антител пациента служит степень подавления связывания меченых реагентов. Чем больше в пробе собственных антител, тем меньше ферментных меток сможет прикрепиться к антигену по сравнению с контрольным образцом (где конкуренты отсутствуют). Для визуализации реакции применяются хромогенные субстраты, реагирующие с ферментом (обычно это пероксидаза или щелочная фосфатаза).
Двусайтовый вариант (сэндвич-метод)
Данный формат используется для поиска антигена. Обязанное условие для проведения сэндвич-анализа — молекула искомого антигена должна обладать как минимум двумя разными эпитопами (участками связывания).
Этапы проведения:
- На поверхности пластиковой лунки жестко фиксируют антитела, специфичные к первому эпитопу искомого антигена.
- Вносят исследуемый образец с антигеном, происходит первичное связывание.
- Сверху наслаивают «вторые антитела», которые распознают второй эпитоп того же антигена.
Для регистрации результатов в классическом варианте применяют антиизотипические антитела, несущие ферментную метку. Однако существует и более современная модификация, повышающая стандартизацию и чувствительность. В ней «вторые антитела» предварительно метят стрептавидином, а выявление производят при помощи биотина, который уже конъюгирован с ферментом. Итоговая концентрация антигена в пробе прямо пропорциональна количеству связавшейся метки.
Смежные методы: проточная цитофлуориметрия
Помимо ИФА, для анализа иммунных клеток активно используется проточная цитофлуориметрия. Метод реализуется на лазерном проточном цитофлуориметре: клетки выстраиваются в один ряд и проходят через тончайший капилляр под лучом лазера.
Прибор автоматически регистрирует параметры светорассеяния:
- Прямое светорассеяние — позволяет оценить физический размер проходящей клетки.
- Боковое светорассеяние — дает информацию о внутренней структуре, в частности о зернистости.
На основе этих данных строится двумерное распределение, позволяющее выделять конкретные клеточные популяции. Для более глубокого анализа применяется флуоресцентное окрашивание. Используя моноклональные антитела, меченые флуорохромами, можно выявлять маркерные молекулы на мембране или внутри клетки. Современные аппараты оснащены несколькими лазерами и способны различать более 10 цветов одновременно. Этот же принцип лежит в основе фракционирования (сортировки) клеток по экспрессии нужных молекул.
Молекулярно-биологические методы
Для детекции иммунологически значимых факторов в диагностике всё активнее применяют инструменты молекулярной биологии. Абсолютным лидером в этой области стала полимеразная цепная реакция (ПЦР), дополняющая классические иммунохимические тесты.
Чтобы запомнить суть сэндвич-метода, представьте бутерброд: нижний кусок хлеба — это фиксированные антитела к 1-му эпитопу, верхний кусок — антитела ко 2-му эпитопу, а котлета посередине — это сам искомый антиген.
Вопросы с занятий и экзамена
Почему в конкурентном ИФА сигнал ниже, если антител больше?
Потому что немеченые антитела из сыворотки пациента занимают места на антигене, не давая связаться меченым антителам из тест-системы. Концентрацию оценивают именно по степени подавления связывания метки.
Для чего в ИФА нужны стрептавидин и биотин?
Это современная система регистрации результатов в сэндвич-методе. Использование стрептавидина на «вторых антителах» и биотина с ферментом позволяет значительно повысить чувствительность анализа.
Что показывают базовые параметры в проточной цитофлуориметрии?
Базовые параметры основаны на светорассеянии. Прямое рассеяние лазерного луча отражает размер клетки, а боковое — её зернистость.
Что ещё разобрать по теме
- Механизм реакции хромогенных субстратов с пероксидазой
- Принципы фракционирования и лазерной сортировки клеток
- Использование моноклональных антител во флуоресцентном анализе
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в иммунодиагностике
- Анализ графиков двумерного распределения в цитофлуориметрии
Разберите тему целиком в курсе «Иммунология»
Здесь — выжимка. В курсе — всё, что спрашивают на занятии и экзамене.
- Полная методичка по теме «Иммуноферментный анализ» и ещё 723 страниц предмета
- Задания и тесты после каждой темы — как на коллоквиуме
- AI-тьютор ответит на вопрос по теме в любое время
- 23 видеоуроков по предмету
Другие темы раздела «Иммунитет в защите и повреждении организма. Патология иммунитета»
Материал подготовлен преподавателями Школы Сеченова по учебной программе медицинских вузов. Носит образовательный характер.